Update project Single Cell

Het project

Om bijvoorbeeld vast te kunnen stellen of een tumor therapieresistent is kunnen verschillen in kankercellen nauwkeurig gemeten worden en ook de gevolgen van therapie voor een kankercel. De huidige technieken hiervoor zijn prachtig, maar erg kostbaar.  Er is nu een nieuwe techniek bedacht die dezelfde uitkomst heeft maar aanzienlijk goedkoper zal zijn, waardoor het ook in de kliniek voor diagnose ingezet kan worden. Deze techniek, waarbij single cell DNA sequencing gebruikt wordt, is het afgelopen jaar getest door Dr. Diana Spiering en dr. Floris Foijer. Het onderzoek is onder andere gefinancierd door de Groningen Swim Challenge 2018. 

Resultaten

Het huidige protocol is tijdrovend en duur. De aanvankelijke aanpak om de kosten van de bibliotheekvoorbereiding te verlagen was gebaseerd op een methode waarbij fragmentatie en adapterligatie van het DNA wordt uitgevoerd in een enkele enzymatische reactie door de Tn5-transposase te gebruiken in combinatie met Illumina-adapters, direct gevolgd door PCR-amplificatie om de cellulaire barcodes te introduceren.

Deze benadering vermindert onder andere het aantal enzymatische stappen. Helaas konden er na vele tests geen goede kwaliteit bibliotheken verkregen worden: de meesten vertoonden een grote variatie waardoor het minder betrouwbaar gemaakt wordt.

Daarom is er besloten om het huidige protocol goedkoper te maken door:

  1. Optimalisatie van de efficiëntie van een gecombineerde eindreparatie
  2. Het poolen van de monsters direct na PCR-amplificatie, gevolgd door een “bulk” Clean-up in plaats van een plaat clean-up met liquid handler system
  3. Vervangen van gelzuivering van samengevoegde bibliotheken door kolomzuivering om adapters verwijderen.

Deze drie stappen resulteerden allemaal in bibliotheken van goede kwaliteit, maar 30% minder kosten voor verbruiksartikelen voor bibliotheekvoorbereiding. De volgende stappen worden nog onderzocht en moeten verder worden gevalideerd en vergeleken met het huidige protocol:

  1. Implementatie van geïndexeerde adapters, waarmee direct pooling mogelijk is waardoor een andere stap voor het opschonen van de korrels wordt weggelaten, het maakt bulk PCR-amplificatie mogelijk.
  2. Vermindering van reactievolumes, wat de kosten verder zal verlagen. Eerst zal dit geïmplementeerd worden op ons Bravo-pipetteerstation met behulp van halve reactievolumes. Later zal dit geïmplementeerd worden op het ICELL8-platform met behulp van nanowell-chips, waardoor nog meer verkleining van de reactievolumes mogelijk wordt.
  3. Vergelijking van momenteel gebruikte reagentia (New England Biolab) met reagentia uit de KAPA Hyper Prep-kit (Roche), die volgens andere studies efficiënter is.

Ondanks de verschillende tegenslagen en daaropvolgende vertragingen, werd er nog steeds enige vooruitgang geboekt bij het verlagen van de kosten van bibliotheekvoorbereiding met 30%. In de komende maanden zal er verder worden geoptimaliseerd en gevalideerd om de kosten zoveel mogelijk te verlagen. Meer steun voor dit project is daarom erg welkom. Doneer o.v.v. Single Cell.

Facebooktwitter